研究人群

这项研究针对 6 名希望改善面部皮肤松弛和皱纹的女性志愿者进行。这些志愿者的年龄从 47 岁到 62 岁不等，平均年龄为 51.1 ± 5.5 岁，她们是从埃及明亚大学医院的皮肤科门诊招募的。治疗和研究细节已向受试者详细解释，并且所有受试者都签署了知情同意书。志愿者的 Fitzpatrick 皮肤类型为 III 至 IV，根据 Glogau 量表，皱纹为 I 至 II 级^。15纳入标准包括因阳光伤害引起的双侧面部变化。排除标准包括怀孕或哺乳、对阳光的光敏感性、任何感染或炎症性皮肤病的迹象、肥厚性瘢痕或瘢痕疙瘩病史、过去 12 个月内使用过口服异维甲酸以及之前进行过面部皮肤年轻化手术。

装置与技术

我们使用了单极射频紧肤仪（Biorad，深圳高仕达科技有限公司，广东，中国），该仪器由射频发生器、计算机化自动电阻测试技术、持续冷却系统和 3 ^cm2尖端组成。射频发生器产生 6 MHz 交流电，在皮肤上形成电场，并通过组织对电流的阻力来加热组织。ThermaCool 仪器（Solta Medical Inc，加州海沃德）和我们的射频仪器的物理特性（包括频率发生器、电场极性频率和能量输出）相同。两种仪器都使用电容耦合而不是传导耦合来传递治疗能量。传导耦合基于集中在电极尖端的能量，导致产生的热量在与电极接触的皮肤表面积聚，这可能导致表皮损伤。电容耦合通过在皮肤表面分散能量来形成一个温度升高的^{区域。10,12}

简而言之，将局部麻醉霜（利多卡因 5%）厚厚地涂抹在治疗区域，封闭 90 分钟后，轻轻地去除霜剂，并将患者摆好治疗姿势。将导电耦合液涂抹在治疗部位，以确保均匀的能量传导，并增强治疗头和皮肤之间的热和电接触。在整个面部进行两次初始照射，每次 150 J，以使胶原蛋白均匀收缩。我们在眶周、鼻唇沟和前额区域进行了三次或更多次额外的照射，每次 200 J。对于每次治疗，每个治疗区域的总照射次数包括在整个面部进行的两次初始照射，然后是针对治疗区域的 3 到 6 次照射（每个治疗区域总共 5-8 次照射）。这些数据描述在表 I中。避免脉冲重叠，以便在两次照射之间让皮肤适当冷却至少 3 分钟。在每次治疗期间，我们都会监测志愿者的不适感和难以忍受的热度；他们中没有人出现任何水肿或热不适的迹象。

治疗方案和随访

志愿者共接受3个月的治疗（6个疗程，每2周一次）。每次疗程结束后，志愿者需避免使用冰袋。此外，为了促进真皮层愈合反应并促进胶原蛋白生成，志愿者需避免日晒。在每次疗程前、疗程结束后以及治疗后3个月拍摄照片。在治疗开始时、治疗结束时和治疗后3个月，从面部皮肤采集3毫米穿刺活检样本。治疗后活检样本取自治疗前活检部位附近的区域。

组织学染色和测量

将组织用10%福尔马林缓冲液固定，石蜡包埋，切成5μm厚的切片。所有组织学和免疫组织化学染色、评估和研究均在美国宾夕法尼亚州费城托马斯·杰斐逊大学皮肤病学和皮肤生物学系进行。采用标准苏木精-伊红染色、Verhoeff-van Gieson染色（弹性纤维）和苦味红染色（直接红80，Sigma，密苏里州圣路易斯）（胶原蛋白）。测量表皮厚度，测量范围为表皮脊顶部（从颗粒细胞层上部）至底部（真皮表皮交界处）。使用计算机软件分析仪对每个组织进行五个测量值计算。使用配备滤光片以提供圆偏振照明的显微镜（Nikon，纽约州梅尔维尔）评估苦味红。使用基于计算机的软件（Image-Pro Plus，Media Cyber​​netics Inc，马里兰州银泉）对免疫组织化学和苦味天狼星红染色进行量化。

免疫组织化学染色

对总弹性蛋白以及I型和III型胶原进行免疫组织化学染色。简而言之，将福尔马林固定、石蜡包埋的组织切片在60°C下加热30至60分钟。然后将组织分别在100%二甲苯（5分钟，3次）、100%乙醇（5分钟，2次）、95%乙醇（5分钟，2次）、75%乙醇（2分钟）、50%乙醇（2分钟）和蒸馏水（H ₂ O）（2分钟）中脱蜡。采用微波法在0.1 mol/L柠檬酸钠（pH 6.0）溶液中处理5分钟进行抗原修复。为了抑制内源性过氧化物酶活性，将组织在室温（RT）下与3%过氧化氢（去离子水）孵育10分钟。使用亲和素/生物素封闭试剂盒（SP-2001，Vector Laboratories，加州伯林盖姆）封闭内源性生物素活性。切片在室温下用封闭缓冲液（5% 正常山羊血清、1% 牛血清白蛋白 [BSA] 和 0.02% triton-x-100 [TX-100] 的磷酸盐缓冲液 [PBS] 封闭 60 分钟。将组织与弹性蛋白抗体（1:300；E4013；Sigma）、I 型胶原抗体（1:400；sc-59772；Santa Cruz Biotechnology，加州圣克鲁斯）和 III 型胶原抗体（1:600；ab6310；Abcam，马萨诸塞州剑桥）在 4°C 下孵育过夜。组织在PBS中洗涤30分钟后，用生物素化的二抗（1:200；PK-6102；Vector Laboratories）在室温下孵育60分钟，然后与ABC试剂（Vectastain Elite ABC过氧化物酶试剂盒小鼠；PK-6102；Vector Laboratories）在室温下孵育30分钟。切片用DAB显色底物试剂盒（K3468；Dako，Real Carpinteria，CA）染色2至5分钟，然后用苏木精（7211；Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA）复染。用Permount（sp15-100；Thermo Fisher Scientific）将载玻片封片，以便用显微镜（Eclipse TE2000-U，Nikon）观察。使用Evolution MP相机（Media Cyber​​netics Inc.）收集数字图像。

统计分析

使用统计学软件包（SPSS for Windows，版本 16，SPSS Inc，芝加哥，伊利诺伊州）对组织学测量和定量评估进行分析。采用单因素方差分析、Wilcoxon 配对符号秩检验和χ2检验^进行统计学分析。数据以平均值±标准差 (SD) 表示。统计学显著性定义为P 值小于或等于 0.05。

临床评估

所有 6 位志愿者均完成了单极射频研究，并显示出眶周和前额区域皮肤紧致度和皱纹的明显临床改善（图 1，A ）。在每个终点（治疗前、治疗结束时和治疗后 3 个月），志愿者、两名医生和两名独立观察员被要求评估以下标准：皱纹的改善、皮肤紧致度和纹理以及志愿者的整体满意度。他们的评估按 5 分量表进行评估（无 = 0%，轻度 = 1-25%，中度 = 26-50%，良好 = 51-75%，非常好 = 76-100%）。将获得的结果制成表格，并使用 Pearson χ ²检验与基线进行比较以确定统计学意义。志愿者的评价率显示在图 1，B中。治疗结束时，受试者的皮肤紧致度改善了 35% 至 40%（ P = .02），皮肤纹理改善了 30% 至 35%（ P = .04），皱纹改善了 40% 至 45%（ P = .01），志愿者满意度为 85% 至 90%（ P = .001）。治疗三个月后，受试者之间出现了显著差异，皮肤紧致度改善了 70% 至 75%（P = .001），皮肤纹理改善了 65% 至 70%（ P = .002），皱纹改善了 90% 至 95%（ P = .0001），志愿者满意度提高到 90% 至 95%（ P = .0001）。至于医生和观察员的评估率，所获得的数据与志愿者的评估率相当。χ2 检验显示，与基线相比，每个标准内的差异均^存在统计学上的显著变化。此外，还评估了潜在的副作用，包括红斑、水肿以及色素减退或色素沉着过度，并采用4分量表（无、轻度、中度和重度）进行评估。仅1名志愿者在第四次治疗后2天出现轻微红斑和轻度一过性色素沉着过度，5天后消退（图1，C ）。未观察到瘢痕形成。

组织学评估显示表皮改变

苏木精-伊红染色切片的显微镜检查显示，治疗结束时表皮增生，并在治疗3个月后持续增生（图2 ）。结果显示，表皮厚度平均值从治疗前的62.7±2.4微米显著增加到治疗结束时的67±3.9微米（ P =0.044），随后在治疗3个月后显著增加到79.5±9.8微米（ P =0.002）（表2 ）。这与表皮整体形态和结构的改善以及表皮脊的发育（真皮表皮连接处明显的起伏）相关。最后，我们观察到颗粒层厚度从治疗前的6.4 ± 1.1 µm增加到治疗结束时的9.9 ± 1.5 µm ，治疗后3个月增加到17.7 ± 3.1 µm （ P分别为0.001和0.0001）（表II和图2 ）。这可能是由于颗粒层细胞数量和大小增加所致。

真皮中弹性蛋白的定量

在光损伤皮肤中，结缔组织蛋白弹性蛋白的水平会增加，并异常地积聚在表皮下，形成所谓的弹性蛋白。接下来，我们通过免疫组织化学染色检查了射频治疗对总真皮弹性蛋白的影响。我们观察到与基线相比，治疗后弹性蛋白水平略有下降，并且在治疗 3 个月后变得更加明显（图 3，A ）。弹性蛋白含量的下降与日光弹性蛋白物质从表皮移位有关，同时还恢复了乳头层和上层网状真皮内正常的弹性纤维。当我们使用计算机形态分析评估弹性蛋白占真皮的百分比面积时，这些结果得到了证实（图 3，B ）。我们发现，射频治疗后弹性蛋白染色略有下降 (49.9 ± 5.3%)，但统计学上无显著差异 (图 3，B )。然而，治疗 3 个月后总弹性蛋白染色出现统计学上显著下降 (42.2 ± 3.6%; P = .007)。

Verhoeff-van Gieson 特殊染色法证实了弹性蛋白含量的变化（图 3，C ）。该染色法有助于区分弹性组织（蓝黑色至黑色）和胶原蛋白（红色）。治疗后，弹性纤维（黑色部分）的含量客观上有所减少，乳头层和网状真皮内的弹性纤维恢复正常。

评估真皮胶原蛋白的变化

对总胶原蛋白的免疫组织化学染色评估（图 4，A ，上排）显示，在治疗前，志愿者的真皮表皮连接处有一条窄的胶原蛋白带（灰色带，9.8 ± 3 µ m）。在治疗结束时，这条胶原蛋白带略微增加到 11 ± 3.6 µ m（ P = .573）。治疗三个月后，皮肤活检样本的染色显示胶原蛋白带的厚度显著增加到 15.6 ± 2.3 µ m（ P = .004）。对真皮阳性胶原蛋白百分比的定量评估显示，I 型胶原蛋白的含量显著增加（图 4，A ，中间排），从治疗前的 65.8 ± 4.7% 增加到治疗结束时的 72.2 ± 4.3%（ P = .034），治疗后 3 个月为 81.2 ± 4.5%（ P = .0001）。最后，对III型胶原蛋白的评估显示，治疗结束时III型胶原蛋白表达显著增加，从基线时的60.9±2.5%增至66.5±4.4%，治疗后3个月增至73.6±4.8%（ P值分别为0.028和0.0001）（表III和图4 B ）。总之，我们的数据显示，射频治疗3个月后，胶原蛋白表达的增强持续增加。

随着胶原蛋白的成熟，纤维的光学特性显示出双折射（在偏振光下变色的能力）增强的迹象，从而导致光穿透力下降。当用苦味天狼星红染色组织并在偏光显微镜下观察时，粗大的胶原纤维被染成红色，而较细的胶原纤维（代表新合成的纤维）则被染成黄色至^{橙色。16,17}为了评估免疫组织化学观察到的胶原蛋白水平升高是否是由新合成胶原蛋白的形成增加所致，我们用苦味天狼星红对组织进行了染色。结果显示，新合成的胶原蛋白形成增加，这通过黄橙色双折射的存在反映出来，从基线时的 15.3 ± 4.3% 显着增加到治疗结束时的 21.7 ± 3.1% 和治疗后 3 个月的 26.9 ± 3.7% ( P = .014 和 .001)（表 III和图 5 ）。